前言技術(shù)分享-- 用于及時(shí)診斷的熒光微球（上篇）

時(shí)間：2023-05-09 13:00:02 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營

時(shí)間：2023-05-09 13:00:02 來源：網(wǎng)站運(yùn)營

前言技術(shù)分享-- 用于及時(shí)診斷的熒光微球（上篇）：

今天給大家介紹一篇來自新加坡國立大學(xué)的張勇教授的研究工作，新加坡國立大學(xué)生物醫(yī)藥工程學(xué)院張勇教授團(tuán)隊(duì)多年來致力于納米熒光材料制備和應(yīng)用研究，主要研究方向?yàn)榧{米熒光材料的可控制備、表面改性和功能化，這篇綜述主要圍繞了熒光編碼微球的制備方法、熒光編碼微球的主要生化應(yīng)用（核酸、蛋白質(zhì)以及CTC檢測(cè)）、基于智能手機(jī)或者可折疊微流控芯片的POCT的應(yīng)用以及主要問題和未來的展望等四大板塊內(nèi)容進(jìn)行闡述。

【背景介紹】

熒光編碼微球具有優(yōu)良的比表面積，提供了更加靈敏的檢測(cè)，同時(shí)熒光編碼微球具有編碼以及解碼過程簡(jiǎn)單，編碼容量大以及可大批量制備等優(yōu)勢(shì)。熒光編碼微球一般利用熒光的發(fā)射波長以及強(qiáng)度進(jìn)行編碼。熒光編碼微球的編碼元件包括半導(dǎo)體的量子點(diǎn)、有機(jī)熒光染料以及上轉(zhuǎn)換納米顆粒等主要編碼元件。

半導(dǎo)體的量子點(diǎn)的發(fā)射光譜窄，熒光穩(wěn)定性好，較寬的的激發(fā)光譜可以實(shí)現(xiàn)多種量子點(diǎn)的單一波長激發(fā)。有機(jī)熒光染料價(jià)格低廉、種類較多，適用于多種編碼方法以及多種材質(zhì)的微球，不同批次間的熒光均一性較好。上轉(zhuǎn)換納米顆粒利用近紅外發(fā)激光，可以避免生物分子背景熒光的干擾，另外可以避免不同發(fā)射波長間的共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

【熒光編碼微球的制備方法】

有機(jī)溶劑溶脹法：聚合物微球在有機(jī)溶劑中溶脹，染料或者量子點(diǎn)等滲入微球內(nèi)部，移除有機(jī)溶劑之后，微球的聚合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)生收縮，并將染料或者量子點(diǎn)包裹在微球內(nèi)部，關(guān)鍵點(diǎn)：調(diào)整染料或者量子點(diǎn)的種類或者濃度可以實(shí)現(xiàn)不同的熒光編碼。

方法改進(jìn)：利用有機(jī)溶劑溶脹-溶劑蒸發(fā)法，利用量子點(diǎn)以及微球的氯仿溶液在密封條件下攪拌2h溶脹微球，之后將溶液在空氣氛圍下攪拌2h，隨著氯仿的揮發(fā)，溶液中的量子點(diǎn)的濃度逐步升高，促使量子點(diǎn)滲入微球內(nèi)部，該方法可以提高熒光編碼微球的熒光穩(wěn)定性以及均一性。

利用該方法最典型的的商業(yè)產(chǎn)品就是Luminex公司的microPlex微球，主要就是利用紅色以及近紅外兩種染料對(duì)聚苯乙烯微球進(jìn)行編碼，兩種染料可以分別設(shè)定10個(gè)濃度梯度，得到100種熒光編碼微球，并開發(fā)了對(duì)應(yīng)xMAP多重樣本分析平臺(tái)，該方法增加了包裹的效率以及量子點(diǎn)分布的均一性。

熒光編碼微球第二種主流制備方法是層層的自組裝法（表面交聯(lián)法/利用疏水作用的結(jié)合）。

層層自組裝法：利用聚電解質(zhì)以及相反電性量子點(diǎn)之間的靜電吸附作用，可以實(shí)現(xiàn)聚電解質(zhì)以及量子點(diǎn)在微球表面的交替結(jié)合。調(diào)整聚電解質(zhì)以及量子點(diǎn)結(jié)合的層數(shù)，可以控制微球表面負(fù)載的量子點(diǎn)的數(shù)量。

表面交聯(lián)法：為了實(shí)現(xiàn)微球表面的固相引物的合成，Nanthakumar等利用高度交聯(lián)，非溶脹的聚苯乙烯微球，通過在微球表面共價(jià)交聯(lián)BODIPY染料分子，實(shí)現(xiàn)熒光編碼寡核苷酸合成載體的制備。微球表面交聯(lián)的染料數(shù)量由染料的濃度而定，利用濃度逐級(jí)稀釋（10倍）的染料溶液，得到四種強(qiáng)度的熒光編碼。

疏水作用結(jié)合：Hu等利用利用疏水作用的方法制備了量子點(diǎn)摻雜的介孔二氧化硅微球，利用該方法制備的量子點(diǎn)摻雜的介孔二氧化硅微球，編碼微球表面結(jié)合聚乙二醇后包裹二氧化硅殼層。二氧化硅包裹后的熒光微球具有非常高的穩(wěn)定性，避免溶劑中的量子點(diǎn)泄露以及化學(xué)誘導(dǎo)的熒光。

熒光編碼微球還有通過包埋法來進(jìn)行制備的，比如利用有機(jī)染料來進(jìn)行編碼，有機(jī)染料編碼：Zhang利用單分散聚苯乙烯微球進(jìn)行種子聚合，羅丹明6G（R6G）染料在聚合過程中被包埋在殼層內(nèi)，調(diào)整染料的濃度可以準(zhǔn)確控制微球的熒光強(qiáng)度，制備了12種不同熒光強(qiáng)度的熒光編碼微球。Liu制備了烯丙基化的羅丹明B、熒光素以及尼羅紅，將染料與聚苯乙烯的單體混合，通過分散聚合制備了三種熒光編碼的微球，染料分子共聚在微球內(nèi)部。有機(jī)溶膠-凝膠法（三聚氰胺–甲醛樹脂微球），染料分子首先與樹枝狀的三聚氰胺-甲醛預(yù)聚物的分子結(jié)合，在預(yù)聚物進(jìn)一步生成微球的同時(shí)，將染料分子包裹在微球內(nèi)部。該方法對(duì)多種染料都有很高的包裹率，微球具有較高的熱以及機(jī)械的穩(wěn)定性，保存過程中幾乎無染料的泄露。

量子點(diǎn)編碼的方法：Yang等利用可聚合的表面活性劑作為乳化劑以及相轉(zhuǎn)移劑，通過改進(jìn)的細(xì)乳液聚合，將3-巰基丙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)均勻包裹在聚苯乙烯微球內(nèi)部。聚苯乙烯具有致密結(jié)構(gòu)以及疏水特性，使得微球的熒光幾乎不受到ph的影響。Graf的將聚乙烯吡咯烷酮修飾的量子點(diǎn)吸附到氨基功能化的二氧化硅微球的表面，在微球表面包裹二氧化殼層，將量子點(diǎn)固定在微球內(nèi)部。Vaidya等在懸浮聚合過程中，將量子點(diǎn)包裹在聚乙烯微球內(nèi)部，調(diào)整量子點(diǎn)的顏色以及數(shù)量實(shí)現(xiàn)了熒光編碼微球的制備。（激光共聚焦顯微鏡分析證明，量子點(diǎn)在微球內(nèi)部呈現(xiàn)多個(gè)團(tuán)聚體分布，微球的發(fā)射光譜與非聚集態(tài)的量子點(diǎn)相比沒有發(fā)生位移。）

刺激響應(yīng)性的水凝膠的方法：Kuang課題組利用N-異丙基丙烯酰胺與4-乙烯基吡啶共聚物（PNIPVP）水凝膠的pH響應(yīng)性，在酸性的條件下將溶脹的凝膠微球與水溶性的量子點(diǎn)進(jìn)行共孵育，微球離心分散在ph=7的水溶液中，凝膠網(wǎng)絡(luò)收縮將量子點(diǎn)包裹在微球內(nèi)部，量子點(diǎn)在微球內(nèi)均勻分布，將不同種類的量子點(diǎn)按照不同比例包裹在凝膠微球內(nèi)，可以獲得不同熒光編碼的凝膠微球。

微流控技術(shù)法來制備熒光編碼微球：Gerver課題組利用了全自動(dòng)的微流控器件，制備了鑭系的納米熒光材料編碼的親水性聚合物微球。鑭系的納米熒光材料、聚乙二醇雙丙烯酸甲酯以及光引發(fā)劑等溶劑在甲醇中作為分散相，在流體通道中生成液滴，再經(jīng)紫外線照射引發(fā)液滴內(nèi)聚合反應(yīng)，就得到熒光編碼微球。Ji等利用微流控技術(shù)，制備了量子點(diǎn)編碼的海藻酸鈣微球，含有量子點(diǎn)、海藻酸鈉的液滴與連續(xù)流動(dòng)相中的鈣離子作用，生成了包裹量子點(diǎn)的海藻酸鈣凝膠微球。利用金字塔狀的微流體網(wǎng)絡(luò)可以實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)逐級(jí)濃度梯度的自動(dòng)化。

最后總結(jié)下熒光編碼微球制備方法的主要優(yōu)點(diǎn)以及不足之處，如下表所示。

【熒光編碼微球的主要生化應(yīng)用】

熒光微球的生化檢測(cè)主要利用兩種方式，一種為懸浮芯片技術(shù)，另外一種方式基于微流控的技術(shù)或者微井陣列的方式。

懸浮芯片的原理如下圖（懸浮芯片的檢測(cè)原理示意圖）所示：編碼微球作為免疫檢測(cè)的載體，所攜帶的編碼信息同時(shí)用作表面結(jié)合探針分子的標(biāo)記。該芯片的分析過程為目目標(biāo)分子先與編碼微球表面負(fù)載的探針分子結(jié)合，再進(jìn)一步與帶有熒光標(biāo)記的報(bào)告分子結(jié)合，形成夾心式結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，微球帶有的編碼信息用于區(qū)分目標(biāo)分子的種類，而報(bào)告分子的信號(hào)強(qiáng)弱則反映目標(biāo)分子的含量。

Simoa技術(shù)將約250,000個(gè)捕獲抗體包被在2.7μm的小磁珠上，檢測(cè)時(shí)加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體及親和素偶聯(lián)的酶和底物，通過一層油將單個(gè)磁珠分別封閉在238,000個(gè)4.5μm的反應(yīng)孔（Well）中進(jìn)行反應(yīng)。由于每個(gè)小孔的反應(yīng)體系僅僅為50飛升，比傳統(tǒng)ELISA小20億倍，這時(shí)小孔中即使只有一個(gè)分子，其催化底物就可產(chǎn)生3000個(gè)熒光分子，通過CCD攝像頭即可捕獲到信號(hào)，利用泊松分布理論可計(jì)算出陽性熒光小孔（OnWell）對(duì)應(yīng)的蛋白濃度值，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化單分子檢測(cè)的愿望。

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