CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)實(shí)操專題一：sgRNA設(shè)計(jì)

時(shí)間：2023-06-02 06:03:01 | 來(lái)源：網(wǎng)站運(yùn)營(yíng)

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CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)實(shí)操專題一：sgRNA設(shè)計(jì)：CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)流程

1.sgRNA設(shè)計(jì)

1.1設(shè)計(jì)原則

1） II型CRISPR系統(tǒng)（SpCas 9）的sgRNA 靶點(diǎn)一般為20nt

2）sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征為NGG (N可以為任意核苷酸)

3）sgRNA的序列應(yīng)避免以4個(gè)以上的T結(jié)尾，GC%含量為30%-70%

4）sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數(shù)都應(yīng)盡可能的高。

5）如果構(gòu)建U6啟動(dòng)子或H1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)載體，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG，來(lái)提高其轉(zhuǎn)錄效率。

6）如果想要造成基因移碼突變，需要盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子上，這可以保證蛋白盡可能多的功能域或結(jié)構(gòu)域失效。

7)基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本時(shí)盡量設(shè)計(jì)在各轉(zhuǎn)錄本的公共區(qū)域。

2.常用設(shè)計(jì)軟件和設(shè)計(jì)流程

1）Broad Institute GPP

網(wǎng)址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design

2）Benchling

網(wǎng)址：https://www.benchling.com/crispr

Benchling和張鋒實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)網(wǎng)站都是比較全面和權(quán)威的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站，以人源TP53基因?yàn)槔榻BBenchling設(shè)計(jì)流程。

1.首先登錄https://www.benchling.com/crispr網(wǎng)站，郵箱姓名注冊(cè)賬號(hào)。

2.點(diǎn)擊左側(cè)第二欄創(chuàng)建一個(gè)sgRNA文件。

3.點(diǎn)擊左側(cè)第四欄“+”，選擇DNA sequence，點(diǎn)擊import DNA sequence，點(diǎn)擊or choose file，導(dǎo)入DNA序列snapgene文件。

4.通常選擇靠近ATG的第一外顯子設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)，點(diǎn)擊右側(cè)“+”點(diǎn)擊DESIGN ANDANALIZE GUIDES設(shè)計(jì) konck on靶點(diǎn)，下方DESIGN HR TEMPLATE 是設(shè)計(jì)konck in靶點(diǎn)。

5.選擇設(shè)計(jì)類型（單靶點(diǎn)，多靶點(diǎn)），靶點(diǎn)長(zhǎng)度（默認(rèn)20bp），物種，PAM序列。

6.選擇一號(hào)外顯子區(qū)域1-74bp，點(diǎn)擊右側(cè)create。

7.共設(shè)計(jì)出8個(gè)靶點(diǎn)，Cut Position表示位置，Strand表示靶向的是正以鏈或反義鏈，以及靶點(diǎn)20bp序列，PAM序列，On-Target靶向靶點(diǎn)和Off-Target脫靶評(píng)分，綜合選擇兩個(gè)評(píng)分相對(duì)較高的靶點(diǎn)保存到sgRNA文件夾或?qū)С鲂蛄?。如果需要?gòu)建載體可以選中靶點(diǎn)，點(diǎn)擊Assemble。

8.選擇載體，點(diǎn)擊Next。

9.選擇保存位置，點(diǎn)擊Assemble。

10.選擇1號(hào)和2號(hào)靶點(diǎn)的FWD和REV引物序列到公司合成，退火后連接到載體上即可。

通常我們針對(duì)一個(gè)靶基因設(shè)計(jì)4-5條sgRNA，在其中篩選出1-2條活性較高的sgRNA，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。