載體構(gòu)建入門攻略——基因編輯載體篇

時(shí)間：2023-06-02 10:15:01 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營(yíng)

時(shí)間：2023-06-02 10:15:01 來源：網(wǎng)站運(yùn)營(yíng)

載體構(gòu)建入門攻略——基因編輯載體篇：基因編輯技術(shù)是指通過核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)改造，實(shí)現(xiàn)特定DNA的定點(diǎn)敲除、敲入以及突變等，最終下調(diào)或上調(diào)基因的表達(dá)，以使動(dòng)植物、細(xì)胞等獲得新表型的一種新型技術(shù)。

目前基因編輯技術(shù)主要包括：（1）鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN)；（2）轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)(TALEN)；（3）規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)簇(CRISPR) 。?目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，可對(duì)基因組DNA進(jìn)行編輯，Cas9蛋白首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，并啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。CRISPR-Cas9技術(shù)在靶點(diǎn)驗(yàn)證、藥物分子的高通量篩選、遺傳性疾病的治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

上圖為CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)中常用的載體。eSpCas9（Enhanced specificity SpCas9），增強(qiáng)特異性SpCas9（eSpCas9）也稱為SpCas9（K848A/K1003A/R1060A），提高了Cas9蛋白對(duì)靶點(diǎn)基因的特異性，由Broad研究所張峰實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（Slaymaker et al.2016）。eSpCas9能夠減少超過10倍的對(duì)目的基因的脫靶效應(yīng)，同時(shí)保持對(duì)靶基因強(qiáng)大的編輯效率。它主要包括以下幾個(gè)部分:

1. ori

ori是origin的縮寫，它是DNA序列上固定的復(fù)制起始點(diǎn)。ori對(duì)于宿主擴(kuò)增質(zhì)粒的能力

至關(guān)重要。

2. U6 promoter

U6啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。U6啟動(dòng)子，屬于真核生物RNA聚合酶III，無物種特異性。

3. CAG enhancer

CAG增強(qiáng)子是DNA上一段能與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。與蛋白質(zhì)結(jié)合后，基因的轉(zhuǎn)錄作用會(huì)增強(qiáng)。

4. FLAG

FLAG標(biāo)簽，適用于基于抗體的親和純化。

5. Cas9

Cas9核酸內(nèi)切酶，該載體上的Cas9蛋白是SpCas9即來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，同時(shí)經(jīng)過突變提高了靶向特異性。另外一種廣泛使用的Cas9蛋白是來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus）的SaCas9。

6.bGH poly(A) terminator

bGH是真核生物mRNA3'端的加尾信號(hào)，用于轉(zhuǎn)錄終止，該信號(hào)終止較弱。常用的轉(zhuǎn)錄終止子還包括SV40、hGH、rbGlob等，終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)較強(qiáng)。

7. f1 ori

f1噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)，其箭頭所指方向?yàn)殒満铣煞较颉?br>
8. AmpR promoter

氨芐抗性基因的啟動(dòng)子

9. AmpR

氨芐抗性基因

CRISPR-Cas9基因編輯載體構(gòu)建

在植物中進(jìn)行基因編輯通常需要同時(shí)構(gòu)建Cas基因表達(dá)盒和sgRNA表達(dá)盒。Cas 基因的表達(dá)通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，以Nos終止子或其他終止子終止；sgRNA表達(dá)盒比較小，一般由長(zhǎng)約300 bp的U3或U6等RNA聚合酶III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，以連續(xù)6個(gè)以上的T堿基終止即可。目前常用的基因編輯載體骨架所有的元件都已構(gòu)建好（包括Cas基因表達(dá)盒和sgRNA scaffold），只需連入與靶位點(diǎn)配對(duì)的那一段sgRNA即可。設(shè)計(jì)合理有效的sgRNA是基因編輯的關(guān)鍵。

下面以人類CD28基因?yàn)槔职咽纸檀蠹胰绾卧O(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)。

1. NCBI分析靶基因信息

關(guān)注基因的轉(zhuǎn)錄本 ID、轉(zhuǎn)錄本數(shù)量、外顯子數(shù)量及長(zhǎng)度、翻譯起始位點(diǎn)等信息。

NCBI網(wǎng)址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

操作提示：第一步，打開NCBI，網(wǎng)址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/，選擇Gene，輸入基因名稱物種：CD28 HUMAN，點(diǎn)擊Search（見圖1）；第二步，點(diǎn)擊第一個(gè)基因（見圖2）；第三步，下拉至轉(zhuǎn)錄本圖形區(qū)，了解常用Genbank數(shù)據(jù)命名形式: NM_標(biāo)準(zhǔn)的編碼轉(zhuǎn)錄本；XM_預(yù)測(cè)的編碼轉(zhuǎn)錄本；XR_預(yù)測(cè)的非編碼轉(zhuǎn)錄本；NR_標(biāo)準(zhǔn)的非編碼轉(zhuǎn)錄本；NC_、NG_、AC為基因組序列。方框表示外顯子，深綠表示編碼區(qū)，淺綠表示非編碼區(qū)。圖形區(qū)可知該基因有3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的編碼轉(zhuǎn)錄本，3個(gè)預(yù)測(cè)的編碼轉(zhuǎn)錄本（見圖3）。

2. 確定靶區(qū)域并獲取序列

挑選靶區(qū)域時(shí)應(yīng)避免選擇與其他基因重疊的區(qū)域，不影響其他編碼基因表達(dá)；盡可能敲除所有轉(zhuǎn)錄本，敲除位點(diǎn)最好在編碼區(qū)的前1/3，且避免敲除ATG所在的位置，確定待設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的外顯子。

操作提示：第四步，針對(duì)轉(zhuǎn)錄本同源區(qū)以最短轉(zhuǎn)錄本NM_001243078.2為例打開轉(zhuǎn)錄本序列，復(fù)制NM_001243078.2用snapgene軟件打開，點(diǎn)擊Import，然后點(diǎn)擊NCBI Sequence。輸入NM_001243078.2，點(diǎn)擊Import（見圖4）；第五步，點(diǎn)擊Sequence，復(fù)制第一外顯子區(qū)域的序列（見圖5）。

3. 設(shè)計(jì)sgRNA

以常用的張鋒實(shí)驗(yàn)室CRISPOR設(shè)計(jì)網(wǎng)站為例，點(diǎn)擊“CRISPOR”， 填入待設(shè)計(jì)的外顯子序列、選擇對(duì)應(yīng)的物種、Cas9類型，設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。（其他設(shè)計(jì)工具，如Benchling設(shè)計(jì)流程請(qǐng)點(diǎn)擊查看。https://zhuanlan.zhihu.com/p/555063579）

網(wǎng)址: https://zlab.bio/guide-design-resources

操作提示：第六步，打開張鋒CRISPOR設(shè)計(jì)網(wǎng)站，點(diǎn)擊CRISPCR。粘貼第一外顯子序列，選擇物種human和Cas9類型 ,以spcas9為20 bp+NGG(PAM)為例，點(diǎn)擊SUBMIT（見圖6）。

4. BLAST比對(duì)靶點(diǎn)特異性

挑選高評(píng)分靶點(diǎn)，進(jìn)行NCBI-blast，Blast結(jié)果分析，Max score完全匹配唯一， 在其他位置至少錯(cuò)配3個(gè)堿基，確保靶點(diǎn)在基因組特異性。
操作提示：第七步，選擇特異性評(píng)分在70以上，預(yù)測(cè)有效性值越大越好，選擇排序前面的靶點(diǎn)（見圖7）；第八步，復(fù)制靶點(diǎn)序列，打開NCBI Blast網(wǎng)站，和基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)靶點(diǎn)特異性，選擇物種human。輸入序列，點(diǎn)擊Blast（見圖8）。結(jié)果顯示，第一個(gè)完全匹配20個(gè)堿基，第二個(gè)匹配17個(gè)堿基錯(cuò)配3個(gè)，表示該靶點(diǎn)在基因組完全匹配一個(gè)，特異性良好。

在關(guān)鍵的的靶點(diǎn)篩選這步結(jié)束之后，接下來就要進(jìn)行基因編輯載體構(gòu)建。在構(gòu)建載體前，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取合適的表達(dá)質(zhì)粒。比如進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考慮是否需要reporter標(biāo)簽，是否需要藥物篩選基因等。首先直接合成含有酶切位點(diǎn)、載體同源序列及20bp的sgRNA靶標(biāo)序列和其反向互補(bǔ)序列；合成的sgRNA正反向堿基（摩爾濃度為100 μM）進(jìn)行退火，使之堿基配對(duì)并形成雙鏈結(jié)構(gòu)；選擇合適的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切質(zhì)粒，并對(duì)酶切后的載體進(jìn)行回收；將退火配對(duì)后的sgRNA堿基與回收后的載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，氨芐抗性固體培養(yǎng)板進(jìn)行涂板；挑取單克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并使用通用引物對(duì)連接載體進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)sgRNA堿基片段是否正確插入載體質(zhì)粒。

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參考資料：

1. Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F (2016) Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351:84–88

2. 基因編輯的原理和載體結(jié)構(gòu)https://zhuanlan.zhihu.com/p/580170374