只需5步，快速學(xué)會(huì)CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)

時(shí)間：2023-06-02 08:39:02 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營

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只需5步，快速學(xué)會(huì)CRISPR/Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)：CRISPR/Cas9可以說是近幾年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最火的技術(shù)了，自2013年誕生以來就光芒四射，給生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來巨大沖擊，CRISPR/Cas9相關(guān)的科研成果頻頻登上頂尖期刊，國內(nèi)CRISPR/Cas9相關(guān)的研究也是如火如荼。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對(duì)與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過人工設(shè)計(jì)crRNA和tracrRNA這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （single guide RNA ），從而引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。


使用CRISPR/Cas9編輯基因成敗的關(guān)鍵就在于sgRNA，在線設(shè)計(jì)sgRNA的網(wǎng)站有很多，本文重點(diǎn)推薦并介紹一個(gè)功能豐富，操作非常簡單的站點(diǎn)http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/，整個(gè)設(shè)計(jì)過程只需5步。點(diǎn)擊文末“閱讀原文”下載PDF版設(shè)計(jì)教程。

第一步

選擇基因編輯類型（敲除，抑制或激活基因表達(dá)等），本文以敲除為例（圖1）。



圖1.選擇基因編輯類型




第二步

輸入基因序列（以人的MYC外顯子2基因?yàn)槔?br>
輸入的基因序列的格式是raw 或 fasta，序列長度為< 10000bp（圖2）



圖2.輸入基因序列


第三步

選擇spacer長度，開始掃描（圖3）

選擇spacer的長度，以19nt為例，點(diǎn)擊scan按鈕即可直接出現(xiàn)該基因序列上（正反鏈）所有可能的sgRNA的序列，開始和結(jié)束位點(diǎn)，分?jǐn)?shù)，以及正反鏈。



圖3.掃描基因正反鏈所有sgRNA

第四步

導(dǎo)出文件（圖4），點(diǎn)擊下方Export to file即可導(dǎo)出所有sgRNA信息的文件



圖4.導(dǎo)出并保存文件




第五步

打開文件，挑選合適的sgRNA（以正鏈為例）（圖5）

在Score這一列顯示每一條sgRNA的敲除效率分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)越高敲除效率越高。但是這些的sgDNA位置有一些并不總在ATG的下游，所以根據(jù)位置，對(duì)于做基因的敲除（KO）而言，強(qiáng)烈建議選擇CDS區(qū)ATG下游通常100aa以內(nèi)范圍的sgRNA。（比如圖4中的6較下游同時(shí)分?jǐn)?shù)較高的）。



圖5.挑選合適的sgRNA


一般針對(duì)一個(gè)基因選擇3到6條sgRNA，選擇合適的sgRNA后便可以克隆載體上了。

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