如何設計CRISPR/CAS系統(tǒng)中的gRNA序列及需注意事項？
時間：2023-06-02 10:57:01 | 來源：網(wǎng)站運營
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如何設計CRISPR/CAS系統(tǒng)中的gRNA序列及需注意事項？：
2021.12.26 利用CRISPR/CAS系統(tǒng)KO靶基因之gRNA設計流程細胞為你講解：今天給大家分享如何利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)敲除靶基因：對目標基因進行精確、高效、可控的遺傳修飾，不光是解決人類面臨重大遺傳疾病、提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)能的潛在技術手段；同樣是推動基礎生物學研究的重要策略。對遺傳信息進行改變包括了誘變技術、基因工程技術。以及后續(xù)基因編輯技術的出現(xiàn)，其大致包括鋅指核酸酶技術(ZFN)、轉錄激活因子效應物核酸酶技術(TALEN）和CRISPR系統(tǒng)中RNA引導CAS蛋白效應核酸酶基因編輯技術。
CRISPR/CAS系統(tǒng)（clustered regularly interspaced palindromic repeats）是細菌進化而成的抵抗外源核酸的免疫系統(tǒng)。目前，發(fā)現(xiàn)的CRISPR/CAS根據(jù)不同的識別和切割的分子機制（主要包括單、多cas蛋白互作、靶向DNA或者RNA等），被分為了3大類。PAM（protospacer adjacent motif）序列是入侵核酸與crRNA靶向序列相鄰的短序列。
CRISPR/Cas9是第二類中依賴gRNA引導單一具有內切核酸酶活心的cas9蛋白形成復合物（sgRNA的3’端是具有結合cas9蛋白的雙鏈RNA結構，負責招募cas9到靶向區(qū)域），實現(xiàn)對核酸DNA效應，依賴細胞中自身的同源重組（HDR）或者非同源末端連接（NHEJ）的途徑，實現(xiàn)目標基因序列改變。其簡單、高效、精確，被廣泛地應用到了生命科學研究。2020年諾貝爾化學獎頒給了法國和美國科學家Emmanuelle Charpentier、Jennifer A. Doudna，以表彰她們“開發(fā)出一種基因組編輯方法”。無疑是CRISPR/Cas9基因編輯技術重要性的體現(xiàn)。
那么如何在日常科研中，利用CAS9系統(tǒng)KO靶基因呢？如何設計有效的gRNA序列呢？現(xiàn)在給大家介紹gRNA設計流程（文獻報道過的有效gRNA可以使用；沒有的話，可以按照下面流程設計）：這里就針對應用CRISPR/Cas9基因編輯人源細胞的P53基因， 利用張峰實驗網(wǎng)站（
http://crispr.mit.edu/）設計關于P53的sgRNA序列常規(guī)步驟：
- 先在NCBI網(wǎng)站上查詢并下載TP53基因組序列。
1、——
>查詢目標基因（加上限定物種） 2、—
—>目標基因基本信息。
—
—>P53基因基因組序列下載，復制目標編輯位點序列信息。- 在瀏覽器中輸入并查詢網(wǎng)站：http://crispr.mit.edu/。
1、
在TOOLS FOR GUIDE DESSIGN項中找并點擊CRISPOR。2
、出現(xiàn)如下頁面—>gRNA 設計頁面，按照提示進行Step步驟設計。3、根據(jù)前面下載P53基因組上序列信息，復制需要進行RNA編輯的目標區(qū)域序列，并粘貼到Step1中，在step2中選擇物種信息，在step3中選擇實驗室常用到cas9蛋白和PAM序列NGG要的選項，然后點擊SUBMIT。舉例A、選取TP53基因前100bp左右粘貼到在step1中（Squence name空欄可不填寫）。
- 根據(jù)網(wǎng)站設計不同的gRNG，選取合適和評分最高的gRNA即可出。
5、最后在設計好的gRNA序列的5’端點引入酶切位點，合成單鏈的正反向序列，酶切鏈接到建好表達載體上（載體有相同酶切位點）。
sgRNA構建注意：- 設計的sgRNA序列5’端20bp序列信息決定了編輯位點，其序列與編輯位點的核苷酸序列互補配對，但前提是靶向區(qū)域存在PAM序列，所以設計sgRNA后面帶有PAM序列（NGG），當sgRNA與靶向片段配對后，cas9蛋白就會在PAM序列前3個核苷酸位置對DNA雙鏈進行切割，形成雙鏈斷裂（DSBs），隨著后面的DNA修復過隨機產(chǎn)生突變，利用突變產(chǎn)生而形成編輯。
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