NCBI在線設(shè)計引物完全教程
時間：2023-06-02 10:42:01 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營
時間：2023-06-02 10:42:01 來源：網(wǎng)站運(yùn)營
NCBI在線設(shè)計引物完全教程：講一下目前應(yīng)用比較穩(wěn)定的設(shè)計引物的方法
以人的β-actin基因為例盡量詳細(xì)的介紹目前設(shè)計QPCR引物的方法
查找基因
如需了解更多實驗方法請關(guān)注“
同名公眾號”
Actin基因的基本信息如下
找到mRNA序列，注意正常設(shè)計引物一般以NM號開頭的為準(zhǔn)，XM多數(shù)為用生物信息學(xué)的方法預(yù)測的到的轉(zhuǎn)錄本信息。Actin只有一個NM號
正常Qpcr設(shè)計引物盡量設(shè)計在CDS區(qū)，actin的CDS信息為193-1320
點擊右側(cè)的Pick Primers
如果需要引物設(shè)計在CDS區(qū)則把相應(yīng)的選定范圍標(biāo)注在相應(yīng)的選擇框內(nèi)，如下圖：
正常QPCR引物一般設(shè)計小于200，我個人一般習(xí)慣100-200之間。紅色標(biāo)注為擴(kuò)增產(chǎn)物大小，藍(lán)色圈出為設(shè)計的引物數(shù)量
一般情況下QPCR引物盡量選擇
跨外顯子設(shè)計這樣可以避免因為提取RNA過程中基因組DNA沒有去除干凈引起的非特異擴(kuò)增的產(chǎn)生。紅色標(biāo)注為選擇必須擴(kuò)外顯子設(shè)計。
另外還需選擇比對的數(shù)據(jù)庫以及種屬，因為之前是從mRNA的界面直接進(jìn)入的設(shè)計引物界面，所以該部分默認(rèn)的與之前mRNA 的界面一致。
點擊get primers，另外個人比較習(xí)慣讓設(shè)計的引物顯示在新的頁面中，所以可勾選Show results in a newwindow選項，這樣如果前面有選項錯誤可重新選擇。
熱騰騰的引物就這么出來了，下圖顯示的是該序列的整體信息及引物在整個序列中的位置
下面顯示的就是第一對引物的詳細(xì)信息。一般引物本事比較需要關(guān)注的就是紅色標(biāo)記的幾個值盡量小于4，藍(lán)色標(biāo)記為引物跨的外顯子的位置，
這里邊反應(yīng)的是引物主觀上的好壞下圖為該對引物比對到的相關(guān)的非特異的其他的一些序列，需要注意比對到的非特異序列，
這里反應(yīng)的是引物在整個數(shù)據(jù)庫中的客觀的好壞。
引物的選擇要綜合考慮引物的自身主觀的質(zhì)量和客觀特異性最終做出選擇。
根據(jù)不同的實驗要求對引物也有不同的要求，當(dāng)然最終評價引物好壞還是要以最終的實驗結(jié)果為準(zhǔn)。
如需了解更多實驗方法請關(guān)注“
同名公眾號”
在線咨詢