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怎樣設(shè)計引物,要具體步驟?

時間:2023-12-12 20:24:01 | 來源:網(wǎng)站運營

時間:2023-12-12 20:24:01 來源:網(wǎng)站運營

怎樣設(shè)計引物,要具體步驟?:開始之前先送大家一個學(xué)習(xí)福利,SCI從來不簡單,否則不會難住那么多人。但是有方法比沒有方法自己領(lǐng)悟快無數(shù)倍。

我和我的伙伴們,從17年就開始幫助醫(yī)學(xué)生醫(yī)生解決SCI困惑,積累了很多經(jīng)驗,下面的學(xué)習(xí)體驗營,是我的36策體驗內(nèi)容,醫(yī)學(xué)生醫(yī)生小白也能入門,相信你也可以完成蛻變。

干貨 | Oligo設(shè)計引物,就是這么簡單

有同學(xué)問貓大了,貓大貓大,PCR引物要怎么設(shè)計才好呢?對于引物設(shè)計,貓大的口號是:兩大要求,一個對策!??!Oligo6,你值得擁有!


好,廢話少說,我們開始。

首先,鼠標(biāo)點擊圖標(biāo)

打開Oligo 6軟件,出現(xiàn)一個標(biāo)著“Select Codon Usage Database”的對話框,不用管它,直接點取消,于是出現(xiàn)如下界面:

軟件界面看著非常簡單,菜單條只有四個選項,菜單條下面是一些快捷按鈕,還有一些按鈕是灰色的、按不動的。實際上,隨著不同的操作,菜單選項和快捷按鈕是會出現(xiàn)變化的。強大的功能就隱藏在這些變化的選項中。

要設(shè)計PCR引物,我們必須要有目的基因序列。這個序列在哪里輸進(jìn)去呢?很簡單,點擊按鈕

,在打開的空白框里,我們可以把目的基因序列貼上去。比如,我們把人TP53基因(AB082923.1)的CDS區(qū)貼進(jìn)去,就變成下面這樣,同時可以發(fā)現(xiàn)菜單條選項忽然就變了,變了,變了。。。

點擊

可以把貼進(jìn)去的序列保存成seq文件。這里我們把這段序列命名為TP53。點擊菜單第二個選項“Accept/Discard”,選中“Accept”,出現(xiàn)如下界面,而且菜單選項又變了,變了,變了。。。

在這個界面里出現(xiàn)了兩個框,一個標(biāo)著ΔG,一個標(biāo)著Tm。標(biāo)著Tm字樣的這個框框左下部有兩個按鈕,分別寫著“Upper”和“Lower”。Upper——Upper Primer,Lower——Lower Primer,好像跟引物有那么點關(guān)系。。。事實是,真的很有關(guān)系。。。所以設(shè)計引物我們只要看標(biāo)Tm的那個框就好了。

PCR引物的長度為15-30bp,最常用23/24bp,我們可以先把需要的引物長度設(shè)定好。怎么設(shè)定呢?

點擊菜單的“Change”選項,選中“Current Oligo Length”,彈出如下對話框:

填入數(shù)字24,點OK,引物的長度就設(shè)定好了。這時候軟件默認(rèn)你接下來選中的引物長度是24bp。

然后我們就用“肉眼”去搜索引物。

Tm圖上標(biāo)著3條平行的虛線,我們要尋找的是Tm值位于第2和第3條線之間的堿基,就是下圖紅色框的范圍。

鼠標(biāo)點擊742bp處,堿基序列上的長方形框就會隨著鼠標(biāo)移動至742bp處,然后點擊“Upper”按鈕,字母顏色就變成紅色,此時已經(jīng)選中742bp處的序列為上游引物,同理選中下游引物(如果想更改下游引物長度,可以在選中下游引物前,進(jìn)去change選項里改。如果不改的話,那這里的下游引物長度就還是24bp),點擊菜單“Analyze”選項選中“PCR”,即彈出這對引物的各項參數(shù),如下圖:


那么怎么知道這對引物好還是不好呢?很簡單,只要這張參數(shù)表的右下框里沒!有!出!現(xiàn)!任何文字,那這對引物就是可用的!“Analyze”選項中還有很多其他評價引物的選項,那些都不用看?。?!

然后,我們需要把引物序列輸出??梢缘絝ile菜單中選擇save去保存引物序列,但是這樣保存下來的是seq文件,還得再打開了看,有點麻煩。所以貓大是直接進(jìn)edit菜單,把引物序列復(fù)制黏貼到excel表,而且復(fù)制黏貼的序列會自動按5’-3’的順序排列。

最后去blast一下,看是不是會擴增出其他基因。如果擴增不出,就可以去合成了。

有時候,選中的引物并不合適,框框里就出會出現(xiàn)討厭的字,比如:

引物間有二聚體,那就隨意挑一條引物挪動幾個堿基;

有兩個可用的溫度,那就還是隨意挑一條引物挪動;

這說明了下游引物的一端穩(wěn)定性太高,那就是說這條引物的堿基對應(yīng)的柱子高了,把它往柱子低一點的地方挪;

上下游引物的末端穩(wěn)定性都太高,那就把兩條都挪往低一點的地方去吧。

這個方法總結(jié)下來就是:


這個軟件用簡單幾個步驟就能一次性完成引物設(shè)計和引物評價兩件事!

而且這么挑出來的引物都相當(dāng)靠譜,基本沒有引物二聚體。用熟練了會感覺自己自帶X光眼,看哪兒、點哪兒,哪兒就是引物!可以跟同學(xué)吹牛皮說:引物不用設(shè)計,眼睛看看就行!

嗯,引物設(shè)計完畢,oligo官網(wǎng):http://www.oligo.net/downloads.html有試用DEMO可以下載哦~

作者:解螺旋·貓大

如需轉(zhuǎn)載請注明來源:解螺旋·醫(yī)生科研助手


關(guān)鍵詞:具體,步驟,設(shè)計,怎樣

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