實(shí)驗(yàn)筆記丨CRISPR-dCas9實(shí)驗(yàn)步驟詳解

時(shí)間：2023-06-02 11:18:01 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營(yíng)

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實(shí)驗(yàn)筆記丨CRISPR-dCas9實(shí)驗(yàn)步驟詳解：


CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的基本原理是，Cas9 蛋白與人工設(shè)計(jì)的 sgRNA 結(jié)合成為 sgRNA-Cas9 蛋白復(fù)合體并在其引導(dǎo)之下結(jié)合到特定的核苷酸序列切割目標(biāo) DNA分子造成雙鏈斷裂，細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接的方式（NHEJ）造成斷裂位點(diǎn)隨機(jī)插入、刪除等突變。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過這種方式引入特定位點(diǎn)的突變。實(shí)驗(yàn)筆記丨CRISPR-dCas9實(shí)驗(yàn)步驟詳解
CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的基本原理是，Cas9 蛋白與人工設(shè)計(jì)的 sgRNA 結(jié)合成為 sgRNA-Cas9 蛋白復(fù)合體并在其引導(dǎo)之下結(jié)合到特定的核苷酸序列切割目標(biāo) DNA分子造成雙鏈斷裂，細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接的方式（NHEJ）造成斷裂位點(diǎn)隨機(jī)插入、刪除等突變。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過這種方式引入特定位點(diǎn)的突變。




dCas9 是通過抑制Cas9 核酸酶的 RuvC 和 HNH 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的活性來得到的，在此之后得到的 dCas9 系統(tǒng)只有結(jié)合基因組序列的能力卻沒有在基因組序列上切割的能力。CRISPR /dCas9 系統(tǒng)分別 融 合 一 個(gè) 激 活 元 件 或 一 個(gè) 抑 制 元 件 時(shí) 會(huì) 產(chǎn) 生 基 因 激 活 或 者 抑 制 的 功 能 。隨著dCas9 發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的成熟，CRISPR-dCas9 系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，逐漸成為科學(xué)家分子生物學(xué)用于激活和抑制基因表達(dá)研究的新工具。




sgRNA 的設(shè)計(jì)




sgRNA，單鏈引導(dǎo) RNA，作為 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中 cas 蛋白的引導(dǎo)序列，可參照 sgRNA 工具網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)多條 sgRNA 以降低脫靶率。




sgRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建方法




1）用 BbsI 在 37℃條件下酶切載體質(zhì)粒 pAC1371。




2）瓊脂糖凝膠電泳，切膠用 DNA 片段回收試劑盒回收目的載體片段




3）引物退火




使用以下參數(shù)在 PCR 環(huán)儀中進(jìn)行退火:





37℃ 30 分鐘，95℃ 5 分鐘，然后以每分鐘降低 5℃的速度將溫度降到 25℃




4）連接酶連接。




5）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（Transformation）

A）取一支儲(chǔ)存在-80℃的 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞放在冰盒里解凍（切不可用手直接握住感受臺(tái)細(xì)胞底部），解凍后將 5-10μL 連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕柔吹混勻（切不可劇烈震蕩吹打），在冰盒里靜置孵育 25-30 分鐘。




B）冰上孵育后將感受態(tài)細(xì)胞放在提前調(diào)節(jié)溫度至 42℃水浴鍋中熱激 90 秒。重新轉(zhuǎn)移冰盒里靜置孵育 5-10 分鐘。




C) 加入 500μL 提前預(yù)熱至室溫的液體培養(yǎng)基，置于 37℃搖床中復(fù)蘇搖菌 1 小時(shí)。




D）3000 轉(zhuǎn)離心 3 分鐘，棄掉部分上清液，用滅菌冷卻至室溫的玻璃棒涂板，置于 37℃培養(yǎng)箱中過夜生長(zhǎng)。




6）隨機(jī)挑取獨(dú)立生長(zhǎng)的菌斑于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6-8 小時(shí)，進(jìn)行菌落 PCR。




7）將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像儀成像，選取陽性菌落送去測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。




8）根據(jù)測(cè)序結(jié)果選取目的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)室用。




脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞




1）準(zhǔn)備：細(xì)胞準(zhǔn)備，將長(zhǎng)勢(shì)良好 HEK293T 細(xì)胞按一定數(shù)量傳代，如：六孔板 1.5*10?/孔，傳代時(shí)培養(yǎng)基需預(yù)熱。




2）將長(zhǎng)勢(shì)良好，密度適當(dāng)?shù)?HEK293T 細(xì)胞更換一半新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)基需要預(yù)熱，更換培養(yǎng)基時(shí)，輕柔操作，不要將貼壁生長(zhǎng)的 HEK293T 細(xì)胞吹起來）。




3）pMD2.G: 1μg+paspax2: 1μg +transgene: 2μg+optimem: 0.125mL 混勻，室溫靜置5 分鐘， lipofectamine 2000：8μL+optimem: 0.125mL 混勻，室溫靜置 5 分鐘。




4）5 分鐘后將步驟 2 中的兩種混合物混合在一起，輕柔混勻，室溫靜置 15 分鐘。




5）將 3）中混合物加入 6 孔板中，每孔加 250μL（加樣時(shí)使混合物均勻分布在孔中）。




6）放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。6 小時(shí)后，去除并更換 HEK293T 細(xì)胞包裝培養(yǎng)基 2mL 。




7）按時(shí)用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況或者熒光表達(dá)情況，并拍照取材。




8）RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄成 c DNA。Real-time PCR 鑒定基因表達(dá)水平。




The surveyor assay of insertion and deletion分析 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在特定位點(diǎn)的作用效率




CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在真核細(xì)胞中切割會(huì)造成 DNA 雙鏈的斷裂，我們采用 Dmitry Y.Guschin 等人用來分析 zinc finger nucleases (ZFN)造成的基因突變得方法來分析CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用效率。這種方法依賴于 Surveyor nuclease 的功能。將發(fā)生突變位點(diǎn)通過 PCR 將產(chǎn)物量放大，重新形成單鏈后退火使正常的序列與發(fā)生突變的序列形成錯(cuò)配，這種錯(cuò)配可以被 Surveyor nuclease 所識(shí)別并切開。通過這種方式可以很清楚的分析 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在特定位點(diǎn)的作用效率。




1）收集 HEK293T 細(xì)胞，1000 轉(zhuǎn)離心 3 分鐘，棄盡上清液，加入 PBS 將細(xì)胞重懸收集在 1.5mLEP 管內(nèi)，用 PBS 洗一次。




2）取適量細(xì)胞 1000 轉(zhuǎn),3 分鐘離心，棄盡上清液。




3）加入 PCR 裂解液（1000 個(gè)細(xì)胞/1μL PCR Lysis buffer）。




4）50℃，1 小時(shí);95℃,15 分鐘;4℃, 10 分鐘。




5）PCR 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 是否有目的條帶。




6) 退火：

3μL PCR 產(chǎn)物




6μL 1xBufferⅡ




95℃,5 分鐘,95–85℃at –2?C/s, 85–25oCat –0.1℃/s; 4℃, 10 分鐘。




7) 將產(chǎn)物放在冰上，加入 0.5μL Surveyor nucLease S 。




PCR 42℃，20 分鐘;4℃, 10 分鐘。




8) 加入 2μL 10×orange Loading buffer




9) PAGE 膠的配置

將洗干凈并烘干的玻璃板用夾子夾住，固定在帶有膠墊的架子上。上層膠和下層膠的組分如下：













10) 待膠凝固后，放在電泳槽中，加入 1×TBE,80V 電壓,預(yù)跑 30 分鐘。




11) 將 5μL 酶切好的樣品點(diǎn)到點(diǎn)樣孔中，使用 100bp DNA maker。




12) 80V 電壓, 30 分鐘; 120V 電壓,90 分鐘。




13) 把跑好的 PAGE 膠在玻璃板中取下，放在帶有 EB 的 1×TBE 中，染色 10 分鐘左右。




14) 凝膠成像，利用 ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析。




PCR 產(chǎn)物送公司測(cè)序，進(jìn)行 TIDE 分析（http://tide-calculator.nki.nl/）


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