一文搞懂！手把手教你精通各類引物設(shè)計(jì)

時(shí)間：2023-06-05 00:18:02 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營

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一文搞懂！手把手教你精通各類引物設(shè)計(jì)：說起引物，做科研同學(xué)并不陌生，應(yīng)用也很廣泛，比如：PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、擴(kuò)增基因片段等。今天給大家介紹不同引物設(shè)計(jì)的方法，并附贈(zèng)超全引物設(shè)計(jì)工具包（點(diǎn)擊附件領(lǐng)取），讓你輕松學(xué)會(huì)！

——引物設(shè)計(jì)工具包——.docx190.9K · 百度網(wǎng)盤01引物簡介及設(shè)計(jì)原則

一、什么是引物

弓|物是人工合成的兩個(gè)寡核苷酸序列:一個(gè)引物與靶區(qū)域-端的一條DNA
模板鏈互補(bǔ),另一個(gè)弓|物與靶區(qū)域另一端的另-條DNA模板鏈互補(bǔ),其功能是作
為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn),核酸聚合酶可由其3 '端開始合成新的核酸鏈。







二、引物的作用

DNA聚合酶在PCR擴(kuò)增過程中只能將新的脫氧核苷酸添加到已存在的3’端,與新的核苷酸的磷酸基團(tuán)形成新的磷酸二酯鍵。引物的作用就是,在PCR退火過程中結(jié)合到正義鏈上，從而提供3’端羥基。







三、引物設(shè)計(jì)的原則

01、基本原則

①引物長度: 15-30bp，常用21bp左右。
②弓|物擴(kuò)增的跨度:以200-500bp為宜，( 具體的長度根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì))。
③G+ C含量以40%-60%為宜G+C太少 ,擴(kuò)增效果不佳,太多易出現(xiàn)非特異性條帶，ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免弓|物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶
⑤引物3’端的堿基應(yīng)該嚴(yán)格要求配對(duì),特別是倒數(shù)第I二個(gè)堿基,以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處(后續(xù)有詳解)

⑦引物的特異性,引物應(yīng)該與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性。
⑧引物量:每條引|物濃度0.1-0.5 μM以最低弓|物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,弓|物濃度偏高會(huì)弓|起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加弓|物形成聚體的機(jī)會(huì)。




02、退火溫度與時(shí)間
退火溫度與退火時(shí)間取決于弓|物的長度,堿基組成及其濃度,目的基因的序列長度




03、引物的復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+ 2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-( 5-109c)
在TM值允許的范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可減少弓|物和模板間的非特異性結(jié)合復(fù)性時(shí)間一般為30-60s。具體時(shí)間取決于擴(kuò)增產(chǎn)物序列的長度


四、延伸溫度與時(shí)間
①常用溫度72°C ,過高的延伸溫度不利于引|物和模板的結(jié)合,延伸反應(yīng)時(shí)間根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定。
②1kb內(nèi) 的DNA的片段延伸時(shí)間 30-60s3-4kb 的DNA的片段延伸時(shí)間 3 -4min10kb_上的DNA的片段延伸時(shí)間 15min
③延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增延伸時(shí)間可稍長- -些 ,不同公司的Taq酶,擴(kuò)增效率不-樣,使用前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書。五、循環(huán)數(shù)
④循環(huán)數(shù)一般在30-40之間,次數(shù)越多非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多




02普通PCR引物的設(shè)計(jì)

一、設(shè)計(jì)網(wǎng)站：

二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小

03表達(dá)載體引物的設(shè)計(jì)

以構(gòu)建鼠源PCMV-TAG2B-gata4表達(dá)載體為例：一般構(gòu)建一 個(gè)表達(dá)載體,我們需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖切枰磉_(dá)全長的蛋白還是其蛋白中的某一個(gè)結(jié)構(gòu)域。 如果是全長,那么我們一般PCR引物擴(kuò)增的跨度就是從轉(zhuǎn)錄起始子ATG到轉(zhuǎn)錄終止子TGA或TAA ,并且注意載體上的起始密碼子需和CDs序列的ATG之間的堿基數(shù)目是3的倍數(shù),以防移碼突變,不編碼目的蛋白。


一、如何查找鼠源gata4的CDs序列?

01、棕色底字體即為小鼠種屬的CDs全長序列1以此序列為模板,將其輸入至primer3.0中設(shè)計(jì)引物。

02、經(jīng)過分析之后，第一引物最優(yōu)，因此我們選擇第一-對(duì)引物,但是,第一對(duì)引物的上游引物與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG相距41bp,為非3的倍數(shù),因此我們需要在弓|物序列之間增加一個(gè)堿基,使得上游弓|物與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG相距42bp,為3的倍數(shù)。因此,最終引物為:

03、引物找到之后,還需要連接至載體上,所以最終的弓|物序列需要和載體有聯(lián)系,能和載體有聯(lián)系的那就是酶切位點(diǎn)。因此,我們需要將gata4CDs序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,-般推薦使用NEBcutter V2.0

網(wǎng)址：http://nc2.neb.com/NEBcutter2/

04、選出一-些不能切目的序列的常見的酶,如方框內(nèi)的酶

結(jié)合前面的的酶切位點(diǎn)分析以及載體上的酶切位點(diǎn)，我們選擇BamHI和XhoI， 因此，選擇這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的同源臂為:

F: GAT AAG AGC CCG GGC GGA TCCR: ATC GAT ACC GTC GAC GAG CTC

所以，經(jīng)分析,構(gòu)建鼠源PCMV-TAG2B -gata4的表達(dá)載體最終的引物序列為:

F: GAT AAG AGC CCG GGC GGA TCCgcattctagttcttgtctgcct
R: ATC GAT ACC GTC GAC GAG CTC agatttgaagagggaagg 政休剛增水eaddoene




04qPCR引物的設(shè)計(jì)

以DNA為模板的qPCR弓|物比較好設(shè)計(jì),跟普通引物的設(shè)計(jì)- -樣, PCR產(chǎn)物長度最好在100-200bp之間。以cDNA為模板的qPCR引物設(shè)計(jì)需要排除基因組的污染,所以在設(shè)計(jì)的時(shí)候最好跨內(nèi)含子,且跨的內(nèi)含子長度越長越好。


為了使內(nèi)含子和外顯子的堿基數(shù)更加直觀,我們一-般推薦使用ensemble數(shù)據(jù)庫。下面以構(gòu)建鼠源gata4基因qPCR弓|物序列為例進(jìn)行介紹。

一、如何查找鼠源gata4的外顯子序列打開ensemb|

網(wǎng)站: http://asia.ensembl.org/index.html

01、在搜索框中將物種選為Mouse ,輸入基因名稱gata4 ,點(diǎn)擊Go。




02、如果是第一-次使用ensemble數(shù)據(jù)庫,需要點(diǎn)擊最下角的Configure page設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)




03、一般的 ,設(shè)計(jì)qPCR弓|物是要跨內(nèi)含子,且跨得堿基數(shù)越多越好,像上圖中,我們就可以選擇2號(hào)外顯子與3號(hào)外顯子的堿基序列設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)的原則同普通PCR引物。




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《每天10分鐘，讓你精通各類引物設(shè)計(jì)》

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