引物設(shè)計(jì) | 最適合萌新入手的兩個(gè)網(wǎng)站
時(shí)間：2023-06-05 00:45:02 | 來源：網(wǎng)站運(yùn)營
時(shí)間：2023-06-05 00:45:02 來源：網(wǎng)站運(yùn)營
引物設(shè)計(jì) | 最適合萌新入手的兩個(gè)網(wǎng)站：RT-PCR引物設(shè)計(jì)需要遵循的主要原則有：
（1）引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并保持特異性；
（2）引物長度一般為15-30bp, GC含量一般為40%-60%；
（3）引物模板序列的Tm值要保持在72℃左右；
（4）引物3’端的堿基滿足四“不”：一“不”：不用A，二“不”：不出現(xiàn)3個(gè)以上連續(xù)堿基（如GGG和CCC），三“不”：不要互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，四“不”：不能終止于密碼子的第3位；
（5）堿基隨機(jī)分布，禁止引物自身和引物之間連續(xù)4個(gè)堿基互補(bǔ)；6、引物的3’端ΔG值低，5’端和中間ΔG值高，呈正弦曲線形狀。
PCR引物設(shè)計(jì)常用軟件有“Oligo”、 “DNAstar”、 “Primer premier”等，操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于剛?cè)腴T的科研小白來說很難上手。
今天給大家介紹一種適合新手的引物設(shè)計(jì)方法，非常適合剛?cè)腴T的新手使用。網(wǎng)站1：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站2：https://www.sangon.com打開
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站，點(diǎn)擊All Databases下拉選項(xiàng)，選擇Gene。
在框內(nèi)輸入目的基因（以Akt為例），搜索Akt如圖，可以看到顯示好多Akt基因，選取對(duì)應(yīng)品種，如小鼠（house mouse）、大鼠（Norway rat）、人（human）等，這里需要選取小鼠（house mouse）品種的Akt。
打開Akt1，下拉網(wǎng)站，選擇NCBI Reference Sequences (RefSeq)中的mRNA and Protein(s)，點(diǎn)擊NM_001165894.1，復(fù)制Akt1的基因序列。
如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)？打開
https://www.sangon.com（生工官網(wǎng)），點(diǎn)開技術(shù)服務(wù)，點(diǎn)擊在線免費(fèi)引物設(shè)計(jì)，將前面復(fù)制的基因序列拷貝到其中，按照提示要求進(jìn)行勾選（以小鼠的Akt基因?yàn)槔?，如下），提交引物設(shè)計(jì)單子。
如何查看引物設(shè)計(jì)結(jié)果？點(diǎn)擊引物設(shè)計(jì)列表，查看結(jié)果即可看到Akt基因設(shè)計(jì)的引物，在進(jìn)行引物合成之前，我們還需要對(duì)設(shè)計(jì)得到的引物進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，通過軟件模擬，觀察其是否能夠擴(kuò)增出我們的目的基因。
如何進(jìn)行引物的BLAST驗(yàn)證？打開
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站，下拉，點(diǎn)擊Primer-BLAST，拷貝前面設(shè)計(jì)好的引物，更改Organism選項(xiàng)為house mouse (taxid:10090)（根據(jù)品系選擇，本例中為小鼠品系），最后點(diǎn)擊Get Primers進(jìn)行BLAST驗(yàn)證（結(jié)果需要等待幾秒），
觀察結(jié)果，如果驗(yàn)證所得基因?yàn)锳kt，即設(shè)計(jì)出來的引物符合要求，可用于進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。以上就是利用
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/和
https://www.sangon.com/兩個(gè)網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的步驟，是不是很簡(jiǎn)單呢？希望對(duì)剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們有幫助！
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關(guān)鍵詞：入手,設(shè)計(jì),適合
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