手把手教你另一種設計PCR引物的方法

時間：2023-06-05 00:51:01 | 來源：網站運營

時間：2023-06-05 00:51:01 來源：網站運營

手把手教你另一種設計PCR引物的方法：之前介紹過用NCBI在線設計引物的方法（在線設計引物一步到位），今天結合網絡一些資料及自身的經驗詳細介紹了用primer5.0設計PCR引物的一些基本原則以及分享了引物設計的方法步驟與資料，希望對于實驗的同學有所幫助。

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一、PCR引物設計原則

1、引物長度一般在15-30bp。

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%。

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右。

Tm值在72℃左右可使復性條件最佳，至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)；

4、引物3’端的堿基一般不用A。

引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。

5、引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

6、引物3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗。

7、如擴增編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率；

8、引物5’端可以修飾。

引物5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

9、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3’端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致引物二聚體帶的 產生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

10、引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。

11、引物應在核酸保守區(qū)內設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

二、Real Time PCR引物設計原則




Real Time PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。

Real Time PCR引物設計原則

擴增片段大小	★	80-150 bp(盡量限制在300 bp以內)
Primer長度	★	17-25 base
GC含量	★	40-60%(最好45-55%)
Tm值	★ ★ ★	兩條引物的Tm值盡量接近，應用專用軟件計算Tm值
序列	★	整體上堿基不能過偏 個別部分避免GC rich或AT rich(特別是3’端) 避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)
3'末端序列	★	3’末端避免GC rich或AT rich3’末端堿基最好為G 或C3’末端堿基盡量避免為T
互補性	★ ★ ★	引物內部或兩條引物之間避免3 base以上的互補序列 引物3’末端避免2 base以上的互補序列
特異性	★ ★ ★	使用BLAST檢索，確認引物特異性
RT-PCR用引物	★ ★ ★	盡量在Exon junction上設計引物，限制基因組DNA擴增

三、常用的引物設計軟件

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“Primer premier”，“Oligo”，“Vector NTI Suit”，“DNAsis”，“Omiga”和“DNAstar”。




下面詳細介紹一下Primer 5.0的用法

1、通過File下的New或Open載入需要設計引物的序列

2、進入到程序的引物設計窗口

3、點擊search，則出現(xiàn)新的界面

在新界面設置你需要設計的引物的相關參數(shù)。主要有五個要設置的地方。第一個地方是選擇設計PCR引物，測序引物和雜交探針，如果要做PCR就選第一個圈圈“PCR Primers”。第二個地方是搜尋模式，一般我們搜索引物是以對搜索，所以一般選"pairs"。第三個地方是正負鏈的所在區(qū)間以及產物的大小長度，這個按自己的需要來，跟實驗目的有關，具體情況具體分析。第四個地方是引物的長度以及正負波動值，一般來說引物長度在18-27范圍內。第五個地方是選擇模式，一般選“Automatic”。設置完上面所說的這些地方后按“OK”鍵，則跳轉到新界面。

4、點擊“OK”，出現(xiàn)如下新界面

顯示結果按照評估分數(shù)從高到低向下排列， 一般選取評估分數(shù)較高的結果。打分是衡量引物質量的綜合性參數(shù)，利用打分系統(tǒng)可以對引物進行有效評估和引物間進行對比選擇提供有效的證據(jù)。如果我們只想要尋找正向或反向的引物，就可以選擇“Sense”或“Anti-sense”按鈕。

5、點擊評分高的結果，就可以顯示引物的詳細信息，如下圖。

該圖左上角的兩個按鈕“s”和“A”

分別代表的是正向和反向引物。該圖中間部分給出了引物的得分，位置，長度，Tm值，GC含量，自由能等信息。該圖最下面的模塊給出了正反引物是否形成發(fā)夾結構，二聚體，錯配以及引物之間的二聚體等情況，紅色代表有。點擊“Found”或“All”我們會看到出現(xiàn)這些結構的具體信息，比如開始的位置，產生的自由能。

6、如果我們對搜索到的引物不滿意，可以手動調整引物的位置，同時可以點擊“Edit Primers”的按鈕對引物進行修改。如下圖，我們可以增加，刪除或修改堿基。直到找到最佳的結果。

7、最后將設計好的引物導出或復制出來。




四、推薦幾款在線引物設計網站




1、 Primer3

http://bioinfo.ut.ee/primer3/

一個廣泛使用的PCR引物設計程序。

2、Primer-BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

在線設計用于聚合酶鏈反應（PCR）的特異性寡核苷酸引物,這個工具同時整合了Primer3和NCBI的Blast功能。

3、GeneFisher

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/

提供一個在線的簡并引物設計工具，基礎是同源基因。

4、Primer3Plus

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

5、BiSearch

http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch

特別推薦設計用于擴增高度冗余的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。提供快速的ePCR方法避免非特異性PCR產物。

6、Web Primer

https://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

斯坦福大學提供的在線引物設計軟件,酵母基因組數(shù)據(jù)庫提供。

7、AutoPrime

http://www.autoprime.de/AutoPrimeWeb

快速設計真核表達實時定量PCR引物在線軟件。




下面就Primer-BLAST的用法做一下介紹

進入NCBI的Primer-BLAST，

1、Primer-BLAST的輸入

Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三個部分：target template（模板區(qū)）, the primers（引物區(qū)）, 和specificity check（特異性驗證區(qū)）。

如下圖，在“PCR Template”下方左側的文本框中輸入FASTA格式的序列或Accession Number，或點擊“選擇文件”載入FASTA格式的文件。右側可以設置正向引物和反向引物的起始和終止位置。在“Primer Parameters”模塊，可以輸入PCR產物的大小和Tm值參數(shù)。如何你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞，可以在此輸入。

2、驗證引物的特異性

在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”區(qū)，選擇設計引物或驗證引物時的目標數(shù)據(jù)庫和物種。這一步是比較重要的。這里提供了7種數(shù)據(jù)庫：RefSeq mRNA, Refseq representativegenomes，nr，RefseqRNA(refseq_rna)，Genome (reference assembly fromselected organisms), Custom, and Genome(chromosomes from all organisms)。推薦使用“Refseq representative genomes”數(shù)據(jù)庫；Genomedatabase (chromosomes from all organisms)是NCBI染色體數(shù)據(jù)庫的舊版本，不再推薦使用；Custom可以使用自己的序列作為搜索數(shù)據(jù)庫。當你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數(shù)據(jù)庫

作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。跟其它的BLAST一樣，點擊底部的“Advanced parameters”有更多的參數(shù)設置。

3、結果界面

上圖是引物的可視化結果，該結果會顯示出所有引物的起始和終止位置，基因的CDS區(qū)，外顯子的位置等。

其次，Primer-BLAST還會給出每一個引物對的具體信息，如下圖。包括引物序列，長度，起始終止位置，Tm值，GC含量，自身互補和3’端互補情況，PCR產物的長度和位置等。其中，Self complementarity和Self 3' complementarity的值越小越好。

如需primer5.0 軟件請關注同名公眾號后臺回復“primer5”